کروماتوگرافی (Chromatoghraphy) ، در زبان یونانی Chroma یعنی رنگ و Grophein یعنی نوشتن است. اولین روشهای کروماتوگرافی در سال ۱۹۰۳ بوسیله میخائیل سوئت ابداع و نامگذاری شد. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد. مارتین و سینج در سال ۱۹۵۲ به پاس اکتشافاتشان در زمینه کروماتوگرافی جایزه نوبل دریافت کردند. توصیف کروماتوگرافی کروماتوگرافی را به دلیل اینکه در برگیرنده سیستمها و تکنیکهای مختلفی است نمیتوان به طور مشخص تعریف کرد. اغلب جداسازیها بر مبنای کروماتوگرافی بر روی مخلوطهایی از مواد بیرنگ از جمله گازها صورت میگیرد. کروماتوگرافی متکی بر حرکت نسبی دو فاز است ولی در کروماتوگرافی یکی از فازها بدون حرکت است و فاز ساکن نامیده میشود و دیگری را فاز متحرک مینامند. اجزای یک مخلوط به وسیله جریانی از یک فاز متحرک از داخل فاز ساکن عبور داده میشود. جداسازیها بر اساس اختلاف در سرعت مهاجرت اجزای مختلف نمونه استوارند.
آشنایی با دستگاه HPLC و انواع کروماتوگرافی مایع با فشار بالا :
- کروماتوگرافی تقسیمی
- کروماتوگرافی تبادل یونی
- کروماتوگرافی جذب سطحی
- کروماتوگرافی طردی
- کروماتوگرافی ستونی
کروماتوگرافی تقسیمی :
در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است. در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از 3000 مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند.
به علت اینکه جداسازی در LLC به میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی می نامند.
کروماتوگرافی تبادل یونی:
در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کنندهکاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند.
یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان یابد.
کروماتوگرافی جذب سطحی:
در روش HPLC از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح سلیکا , سیلانول می باشند. در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیلانول بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها دارد.
معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در 150 تا 200 سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد.با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود.
کروماتوگرافی طردی:
روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب روماتوگرافی ژل تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد.
کروماتوگرافی ستونی:
در کروماتوگرافی ستونی جسم بین فازهاى مایع و جامد پخش می شود. فاز ساکن جسم جامدی است و این جسم اجزای مایعی را که از آن میگذرد به طور انتخابی در سطح خود جذب می کند و آنها را جدا می کند. اثرهایی که باعث جذب سطحی می شوند همان اثرهایی هستند که موجب جذب در مولکولها می شوند. این اثرها عبارتند از: جاذبه الکترواستاتیکی، ایجاد کمپلکس، پیوند هیدروژنی، نیروی واندروالس و غیره. برای جدا کردن یک مخلوط با کروماتوگرافی ستونی، ستون را با جسم جامد فعالی (فاز ساکن) مانند آلومینا یا سیلیکاژل پر می کنند و کمی از نمونه مایع را روی آن می گذارند. نمونه ابتدا در بالای ستون جذب می شود. سپس حلال استخراج کننده ای را در داخل ستون جریان می دهند. این فاز مایع متحرک، اجزای مخلوط را با خود می برد. ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی فاز جامد، اجزای مربوط میتوانند با سرعتهای مختلفی به طرف پایین ستون حرکت کنند. ترکیبی که با نیروی کمتری جذب فاز ساکن شود سریع تر خارج میشود زیرا که درصد مولکولی آن در فاز متحرک از ترکیبی که با نیروی زیادتری جذب فاز ساکن می شود بیشتر است.
قدرت استخراجی حلالهای مختلف (یعنی توانایی آنها در انتقال یك جسم معین به پایین ستون) بترتیب زیر زیاد میشود:
آب >متانول>اتانول>پروپانول>استون>اتیل استات>اتیل اتر>کلروفرم>دی کلرومتان>بنزن>تولودن<تتراکلرید کربن<هگزان
معرفی و مشخصات دستگاه گاز کروماتوگرافي ( GC )
از دستگاه گاز کروماتوگرافي ( GC ) براي شناسايي و تعيين مقدار استفاده مي شود. در گاز کروماتوگرافي ( GC ) با دو فاز سر و کار داريم : فاز ساکن و فاز متحرک ، فاز متحرک يک گاز است و فاز ساکن مي تواند مايع يا جامد باشد. فاز متحرک هيچ نقشي در جداسازي ندارد و يکي از تفاوت هاي GC با HPLC همين موضوع است. در HPLC فاز متحرک يک مايع است که در جداسازي نقش دارد. تنها نقش فاز متحرک در GC حمل مواد به جلو و خارج کردن آنها از ستون است. به همين دليل کيفيت جداسازي در HPLC بهتر است از GC.
ابتدا نمونه را توسط سرنگ داخل injector تزريق مي کنيم. نمونه پس از ورود به injector به بخار تبديل شده و با فاز متحرک مخلوط شده ، وارد ستون مي شود. نمونه جذب ستون مي شود و در زمانهاي مختلف به وسيله گاز بي اثر از ستون بيرون مي آید و وارد دتکتور مي شود. ستون قلب دستگاه است زيرا عمل اصلي که جداسازي است در آنجا انجام مي شود. دتکتور شناسايي را انجام مي دهد جهت شناسايي مواد با GC از Rt) Retention time ) استفاده مي شود. Retention time زماني است که طول مي کشد تا جسم از دتکتور بيرون بيايد ، يعني از زمان تزريق نمونه تا زمان ظاهرشدن پيک ها روي دستگاه که براي يک ماده تحت شرايط ثابت ، مقداري ثابت است. بنابراين از مقايسه Rt معلوم با Rt مجهول، مي توان اجزاي موجود در مجهول را تشخيص داد. اگر مجهول و استاندارد، Rt يکسان داشتند، مي توان نتيجه گرفت که هر دو نمونه يکي هستند.
پارامتر مهم ديگر در GC ، سطح زير منحني ( AUC ) است. رکوردر به ما کروماتوگرامي مي دهد که در راس هر پيک Rt را مي نويسد و AUC مربوط به آن را هم مي دهد پس کروماتوگرام حاوي دو اطلاع ارزنده است:
1- Rt براي شناسايي کيفي جسم
2- AUC براي تعيين مقدار کمي جسم
گاز حامل : يک گاز بي اثر است (He,( H2, N2 ، He از همه بهتر است ولي چون گران است کاربرد کمي دارد. نگهداري H2 هم خطرناک است چون قابليت انفجار دارد، بنابراين N2 استفاده مي شود.
سليندر:
حاوي گاز حامل، در بيشتر دستگاه ها از گاز ازت که گازي خنثي، ارزان و در دسترس است استفاده مي شود.
فلومتر:
توسط اين قسمت از دستگاه تنظيم فشار گاز حامل صورت مي گيرد که اگر نمونه سريعتر بيرون بيايد ممکن است دو پيک روي هم بيفتند. هر چه فلو بيشتر باشد، مواد سريعتر از ستون خارج مي شوند.. فلو برحسب ml/min است. ( در کار با GC بايد نوع گاز حامل و flue آن ذکر شود ).
محل تزريق نمونه (injector) :
دو محل تزريق در بالا و پائين وجود دارد که نمونه را به سرعت و توسط يک سرنگ در يکي از آنها بسته به اينکه از ستون بالايي يا پاييني استفاده مي کنيم تزريق مي کنيم. با GC مي توان نمونه هاي با حجم هاي بسيار کم تا دهم هاي ميکروليتر را اندازه گيري نمود.
ستون (column) :
ستون نقش اصلي جداسازي را به عهده دارد که از جنس هاي مختلف مي باشد:ستون فولادي،مسي ، شيشه ايي يا استيل باشد که سخت پر مي شود و حتما بايد توسط کارخانه سازنده پر شود.
ستون مسي انعطاف پذيري خوبي دارد و به راحتي پر مي شود زيرا مي توان آن را به صورت مستقيم پر کرد و سپس به صورت مارپيچ در آورد. ولي عيب آنها تشکيل اکسيد مس در جداره ستون مي باشد که مي تواند برخي واکنش ها را کاتاليز کند. در حالي که ستون هاي فولادي اين عيب را ندارند. ستون هاي شيشه اي که مزيت آنها اين است که داخل آنها را مي توانيم مشاهده کنيم بنابراين اگر هوا گرفته باشد متوجه مي شويم و عيب آنها شکننده بودنشان است. ستون هاي فولادي خيلي مستحکمند و بايد در کارخانه بصورت مارپيچ در ايند ، بنابراين پرکردن آنها مشکل است و احتياج به دستگاه ويبراتور داريم. يک ويژگي مهم و تاثير گذار در ستون ها پلاريته آنهاست که توسط کارخانه سازنده مشخص مي شود که بر اين اساس مي توان ستون هاي مشابه را انتخاب کرد.
براي فاز مايع از خاکه آجر يا chromosorb p که بي اثر است براي تثبيت مايع استفاده مي کنند آن را پر مي کنند. و مايع ديرجوش را روي خاکه آجر مي دهند و تثبيت مي کند که معمولا پارافين يا silicon greas است.
Oven :
Oven قسمت گرم کننده است. سه قسمت از دستگاه بايد گرم شوند. Injector, oven و Column (که دو عدد هستند و در بالا و پايين oven قرار مي گيرند) و نيز Detector قرار دارد. دماي ستون بايد چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين جزء موجود در نمونه باشد مثلا اگر بالاترين نقطه جوش ۱۵۰ درجه سانتيگراد باشد، دماي ستون ۱۷۰ درجه سانتيگراد باشد. دماي injector بايد چند درجه بالاتر از ستون و دماي دتکتور هم چند درجه بالاتر از injector باشد با ستون با دو برنامه دمايي مي توان کار کرد: اگر روش کار ايزوترمال باشد به oven يک دماي ثابت مي دهيم اما اگر به روش برنامه ريزي کار کنيم ، بايد به آن برنامه دمايي بدهيم.
- روش Isothermal :
در اين روش با يک دماي ثابت کار مي کنيم ، بيشتر زماني استفاده مي شود که در نمونه فقط يک ماده مورد شناسايي وجود دارد يا اگر چند ماده وجود دارد، نقطه جوش آنها نزديک به هم است.
- روش برنامه ريزي دمايي (programming) :
در مواقعي استفاده مي شود که مواد موجود در نمونه Range وسيعي از نقطه جوش دارند و اگر ابتدا دماي Oven را بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين ماده قرار دهيم ، مواد با نقطه جوش کمتر تجزيه خواهد شد و نمي توان آنها را شناسايي کرد. بنابراين طوري دما را تنظيم مي کنيم که با سرعت مشخصي از چند درجه بالاتر ازمواد به ترتيب نقطه جوش از ستون بيرون مي ايند يعني هر چه تعداد کربن هاي ماده بيشتر باشد ديرتر بيرون مي ايند و پيک آنها ديرتر ظاهر مي شود. وقتي نمونه اي حاوي چند جزء با طيف وسيع BP است نمي توان از روش ايزوترمال استفاده کرد زيرا با داشتن فقط يک دما ، ممکن است يک جزء خيلي سريع بيرون بيايد و از دست برود يا بيرون آمدن آن ، زمان طولاني ببرد. بنابراين بايد از روش Programming استفاده کنيم ، يعني از چند Oven استفاده کرده و به هر يک ، دمايي خاص مي دهيم.
- آشکارساز (Detector) :
دتکتور بر اساس پاسخي که مي دهد به دو دسته تقسيم مي شود :
دتکتور انتگرالي ، که پاسخ انتگرالي مي دهد. که امروزه منسوخ شده است.
دتکتور تفکيکي ، پاسخ اين دتکتور به اين صورت است که وقتي گاز حامل به تنهايي مي ايد، خط صاف و وقتي به همراه نمونه مي ايد يک پيک مي دهد.
يکي از دتکتورهاي تفکيکي که در GC استفاده مي شود Flame Ionization Detector (FID)مي باشد. نمونه ها بعد از اينکه از ستون خارج مي شوند وارد دتکتور مي شوند. نمونه ها در شعله دتکتور مي سوزند و ايجاد يون و الکترون مي کنند. آنچه مهم است الکترون هايي است که توليد مي شوند. الکترونها جرياني را که از FID عبور مي کند افزايش مي دهند و غلظت نمونه متناسب با افزايش ميزان جريان است.
براي تشکيل شعله از سوخت هيدروژن با اکسيژن هوا استفاده مي شود. براي تامين اکسيژن هم از کپسول هوا استفاده مي شود. نشانه روشن بودن دستگاه دتکتور اين است که بخار آب از آن خارج شود. FID حساسيت بالايي دارد و عيب آن تخريب نمونه است. ( نوع دتکتور هم بايد در کار تحقيقاتي ذکر شود ).
- رکوردر ؛ چگونگي تنظيم دما:
دماي ستون را چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوشترين جزء موجود در نمونه قرار مي دهيم و دماي injector را چند درجه بالاتر از ستون و نيز دماي دتکتور نيز چند درجه بالاتر از دماي injector قرار مي دهيم.
برنامه دمايي ايزوترمال:
70 درجه سانتيگراد = oven
۹0 درجه سانتيگراد = Injector
۱۰۰ درجه سانتيگراد = Detector
mLit = مقدار تزريق
علت استفاده از استاندارد داخلي :
در روش AUC بايد از استاندارد داخلي استفاده کنيم که علت استفاده از استاندارد داخلي ، حذف خطاي حاصل از حجم تزريق مي باشد. زيرا حجم تزريق کم است و احتمال اشتباه زياد مي باشد و براي استفاده کمي و حذف اين خطا از يک استاندارد داخلي که از لحاظ ساختمان شيميايي نزديک به نمونه باشد استفاده مي کنيم مثلا براي تعيين مقدار اتانول ، از بوتانول به عنوان استاندارد داخلي استفاده مي کنيم زيرا از لحاظ ساختمان شيميايي نزديک به نمونه اتانول است بنابراين ضمن اينکه پيک هاي مربوط به هر کدام جدا مي باشد، خيلي هم از هم فاصله ندارند.
