کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله تکنیکهای جداسازی (Separation) مرسوم در بسیاری از علوم است. در این مقاله ابتدا به تاریخچهای از کروماتوگرافی، اصطلاحات و روابط آن اشاره میشود و در ادامه به نحوه انتخاب دقیق پارامترهای دستگاهی وآزمایشگاهی به منظور انجام یک جداسازی کارآمد اشاره میشود. پارامترهایی از قبیل انتخاب نوع ستون و انتخاب فاز متحرک که به قطبیت آنالیت بستگی دارد و یا انتخاب آشکارساز مناسب که به ساختار و ویژگیهای شیمیایی نمونه بستگی دارد؛ و در نهایت به نحوه آنالیز کمی و کیفی کروماتوگرام اشاره میشود.
1- مقدمه و تاریخچه کروماتوگرافی:
بدون شک مهمترین و پرکاربردترین روش جداسازی، روش "کروماتوگرافی" است. کروماتوگرافی (Chromatography)، بوسیله یک گیاهشناس روسی به نام تسوت، در اوایل قرن بیستم (1903) کشف شد. او از این تکنیک برای جداسازی رنگدانههای مختلف گیاهی مانند کلروفیلها و گزانتوفیلها استفاده کرد.
روشهای کروماتوگرافی بر پایه دو مفهوم کلی دستهبندی میشوند: در روش اول، جداسازی بر اساس مفاهیم فیزیکی صورت گرفته و شامل دو گروه کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است.
اساس نامگذاری در دستهبندی دوم که مرسومتر است، نوع فاز متحرک، فاز ساکن و همچنین نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است. این دسته شامل دو گروه کلی کروماتوگرافی مایع (فاز متحرک، مایع میباشد) و کروماتوگرافی گازی (با فاز متحرک گاز) است.
2- مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی
درتمامی روشهای کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام میشود. این تفاوت مقدار، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی میگردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان میکنند. در این رابطه Cm و Cs به ترتیب نشاندهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.
3- کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
3-1- فاز ساکن و فاز متحرک
هیدروکربن < اترها < استرها < کتونها < آلدئیدها < آمیدها < آمینها < الکلها
خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:
• قابلیت تطابق با آشکارساز
3-2- اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
1- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشودهنده ستون ریخته شده است.
> حساسیت بالا
> غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی، نمونه را تخریب نکند.
> پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)
از میان تکنیکهای جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیونها دلار صرف خرید و فروش دستگاههای HPLC در دنیا میشود. علت این رشد را میتوان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونههای غیرفرار و حساس به دما که با تکنیک GC (کروماتوگرافی گازی) امکانپذیر نیستند، نسبت داد.
3-1- فاز ساکن و فاز متحرک
در مورد قطبیت فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حلشونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن < اترها < استرها < کتونها < آلدئیدها < آمیدها < آمینها < الکلها
خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:
• درصد خلوص بالا (حلالهایی با درصد خلوص بسیار بالا، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد)
• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون (به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار میشود)
• واکنشپذیری کم (Inertness)• قابلیت تطابق با آشکارساز
3-2- اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمتهای مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره میشود:
1- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشودهنده ستون ریخته شده است.
2- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده میشود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده میشود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین میگردد. در مواردی که با تعددی از آنالیتها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان میدهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیکها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته میشود که در ستونهایی با قطر مرسوم (کمتر از 5mm)، سرعت جریان نباید بالاتر از 2/5 ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن میشود.
به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلالها در ازای یک حلال خالص میتواند بهکار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته میشود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته میشود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامهای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان مییابد.
3- تزریقکننده (Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام میگیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار میگیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرمافزار) میدهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل میشود. در روش دستی، از سرنگهایی با ظرفیتهای مختلف برای تزریق نمونه استفاده میشود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونهبردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون میشود.
4- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیشستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column) میشود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتیمتر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر مادهای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمیکند. طول ستونهای اصلی دستگاه معمولا حدود 30-10 سانتیمتر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوستهدار و یا متخلخل است، پر کردهاند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد 3 تا 5 میکرومتر است.
ستون میتواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسومترین ستونهای غیرقطبی میتوان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمانهای متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector) هدایت میشوند.
در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب میکنیم. برای مثال در ستونهای غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو میدهند.
5- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب میشود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگیهای زیر باشد:
> حساسیت بالا
> غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی، نمونه را تخریب نکند.
> پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)
